Het verschil tussen honden en wolven is bovendien eerder klein: honden zijn zo’n tienduizend jaar geleden ontstaan uit wolven (Fan et al. 2016), en de enige echt belangrijke verschillen die er in die periode ontstaan zijn, zijn het gevolg van domesticatie zelf: kenmerken gelinkt aan gedrag, lichaamsbouw en grootte, vachtkleur en -structuur. Het merendeel van het genetisch materiaal van honden wordt nog steeds gedeeld met wolven.
In het genoom van elke wolf is er zo’n 1-5% DNA dat we niet kunnen onderscheiden van honden, en vice versa. Of dit voorouderlijke variatie is, of het resultaat van oude vermenging is niet altijd uit te maken, zelfs niet met de meest geavanceerde genomische analyses (Smeds et al. 2021). Dus vanaf welke hoeveelheid honden-DNA spreken we dan van een hybride?
Alle mensen zijn technisch gezien ook hybriden: elke mens heeft zo’n 1% tot 6% DNA in zich van een andere intussen uitgestorven mensensoort (Witt et al. 2022), maar we beschouwen onszelf daarom niet als hybriden. In de praktijk beschouwen we een wolf als een hybride wanneer we meer dan 5% van het DNA met grote statistische betrouwbaarheid kunnen toewijzen aan honden. Dat komt ongeveer overeen met een derde-generatie-terugkruising.
Standaard Genetische Monitoring van Wolven in Europa
Er wordt in Europa op een standaard manier gekeken naar de genetica van wolven. Ook Nederland maakt deel uit van een groep onderzoekslaboratoria uit verschillende landen, waaronder Duitsland, Denemarken, Polen, Tsjechië, Oostenrijk, Nederland en België. Ze voeren genetische monitoring van wolven uit volgens een vergelijkbare aanpak (CEwolf-consortium) en delen gegevens in een gezamenlijke databank.
Om hybriden te detecteren, beginnen ze met het verzamelen van speekselsporen, een plukje haar of uitwerpselen van wolven. Vervolgens wordt het DNA geïsoleerd, inclusief het DNA van de prooi. Ze voeren drie opeenvolgende analyses uit op dit DNA-extract.
Eerst kijken ze naar het aantal kopieën van het Amy2B-gen, dat codeert voor een enzym dat helpt bij de vertering van zetmeel. Als er meer dan 2 kopieën per genoom worden gevonden, weten ze dat er DNA van honden aanwezig is.
Ten tweede controleren ze het mitochondriaal DNA, een DNA-streng die alleen via de moederlijn wordt doorgegeven. Hierbij kijken ze naar een korte maar zeer variabele regio, de "Control Region" (CR). Verschillende varianten van deze regio zijn typisch voor Europese wolven of honden. Dit helpt hen bij het identificeren van de herkomst van het DNA.
Ten derde identificeren ze individuele wolven met behulp van een methode die ook in forensisch menselijk onderzoek wordt gebruikt. Ze gebruiken twee markers om het geslacht te bepalen en 12 variabele microsatellietmerkers voor een unieke genetische vingerafdruk. Deze genetische informatie wordt opgeslagen in een gedeelde databank, inclusief details over de plaats en datum van het gevonden DNA-staal.
Met behulp van deze genetische gegevens heeft het CEwolf-consortium al meer dan 3000 wolven geïdentificeerd in de Centraal-Europese populatie sinds 2005. Ze hebben ook stambomen opgesteld voor honderden individuen, soms wel 10 generaties teruggaand.
Detectie van Hybride: wel of niet?
Het vaststellen van hybride wolven en honden is geen eenvoudige taak vanwege hun nauwe genetische verwantschap. Hoewel commerciële laboratoria zoals het in Hamburg gevestigde ForGen tests aanbieden om de vermoedelijke rassen van de voorouders van een bastaardhond te identificeren via DNA-analyse, zijn deze niet altijd geschikt voor het aantonen van hybridisatie. Dit leidt vaak tot verwarring en verkeerde interpretaties van gegevens.
Het haplotype
ForGen maakt gebruik van hetzelfde DNA-segment als CEwolf om een haplotype te bepalen en te beoordelen of het monster afkomstig is van een wolf. Hoewel het resultaat direct vergeleken kan worden met internationale databases zoals Genbank, leidt dit niet altijd tot nauwkeurige conclusies. Een voorbeeld van een resultaat kan zijn: "Canis lupus chanco isolate WN03 (China), Canis lupus haplotype W23 (Estland), Canis lupus isolate Ukraine (Oekraïne)." Dit kan verkeerd worden geïnterpreteerd als een wolf uit China, Estland of Oekraïne, maar het kan ook DNA van andere hondenrassen bevatten. Het resultaat toont eerder aan dat bepaalde genetische varianten voorkomen bij zowel wolven als honden, wat niet noodzakelijk wijst op hybridisatie.
Genotypen en associatieanalyse
Het gebruik van microsatellietmarkers om betrokken hondenrassen te bepalen, is niet altijd relevant voor wolven-DNA. Deze associatieanalyse gaat uit van het principe dat door inteelt binnen rassen veel genetische variatie verloren is gegaan. Dit principe is echter niet van toepassing op wolven, omdat zij de stamvaders zijn van alle honden en een bredere genetische variatie behouden. Daarom kunnen resultaten van associatieanalyse, zoals percentages die horen bij bepaalde hondenrassen, misleidend zijn. Ze tonen eerder genetische variatie aan die gedeeld wordt tussen wolven en honden.
Commerciële tests zoals de Embark Dog DNA Test maken gebruik van DNA-chips met honderdduizenden merkers om nauwkeurig hondenrassen en hybriden met wolven te identificeren. Embark claimt een precisie van 95% tot 99% en geeft een "wolfiness-score" die aangeeft in hoeverre genetische markers typerend zijn voor wolven. Deze score betekent niet noodzakelijk recente hybridisatie, maar kan oude, gedeelde genetische variatie tussen honden en wolven aangeven. Bij analyse van bekende wolven geeft deze methode betrouwbaar 100% wolf als resultaat.
Echter, wanneer je maar heel weinig DNA hebt en van lage kwaliteit (zoals een druppel speeksel in een bijtspoor op een prooirest) is het niet mogelijk om te screenen op honderdduizenden varianten.
Screenen van hybridisatie bij Europese wolven
Het opsporen van hybridisatie tussen honden en wolven, zowel oud als recent, staat hoog op de prioriteitenlijst voor het behoud van gezonde wolvenpopulaties (Salvatori et al. 2020). Er is uitgebreid onderzoek gedaan om betrouwbare identificatie mogelijk te maken. Vooral in regio's met veel verwilderde honden, zoals Kroatië, NW-Spanje, Z-Italië, is hybridisatie niet zeldzaam. Het recent gestarte Biodiversa+ project "Wolfness", gefinancierd door de EU (https://www.biodiversa.eu/2023/04/19/wolfness/)
, heeft als doel een gestandaardiseerde toolbox te ontwikkelen voor de identificatie van hybriden tussen wolven en honden, het screenen van wolvenpopulaties in heel Europa, en het evalueren van het Europese beleid met betrekking tot hybridisatie.
Recente onderzoeken hebben het complete genoom van honderden honden en wolven bestudeerd (Smeds et al. 2021) of honderdduizenden genetische varianten gescreend om de betrouwbaarheid van identificaties te bepalen (Caniglia et al. 2020). Soms zijn er gedetailleerde stambomen beschikbaar van wolven die teruggaan tot wel 10 generaties (via bijvoorbeeld de CEwolf-databank of een vergelijkbare Scandinavische databank; Smeds et al. 2021). Hierdoor kan met grote zekerheid worden vastgesteld of een bepaald monster afkomstig is van een zuivere wolf. Voor Scandinavische populaties (Smeds et al. 2021), Centraal-Europese populaties (Harmoinen et al. 2021), Zwitserse (en Franse) wolven (Dufresnes et al. 2019), Noord-Italiaanse wolven (Caniglia et al. 2020) en Iberische wolven (Stronen et al. 2022) blijkt hybridisatie een marginaal fenomeen te zijn dat nauwlettend wordt gevolgd. Zodra een hybride wordt gedetecteerd, hetzij door uiterlijke kenmerken of genetische screening, wordt toestemming verleend om het dier uit te schakelen. In Zuid-Italië is de situatie echter complexer, met regelmatig voorkomende wolven die meer dan 20% DNA van honden bevatten als gevolg van decennia van wanbeleid met verwilderde honden. Hoe deze complexe situatie aan te pakken, is het onderwerp van het Wolfness-project.
DNA-Analyse van speekselstalen van prooien
Aangezien het werken met duizenden genetische markers niet haalbaar is voor DNA van forensische kwaliteit (bijvoorbeeld een beetje speeksel van een wolf in een overvloed aan prooi-DNA), heeft CEwolf een efficiënte methode ontwikkeld met slechts 93 markers met elk twee varianten. Een variant komt (bijna) uitsluitend voor bij honden, terwijl de andere variant (bijna) uitsluitend bij wolven voorkomt. Deze varianten bevinden zich op DNA-locaties die systematisch verschillen tussen wolven en honden, niet door inteelt, maar door natuurlijke selectie, en overspannen verschillende hondenrassen (Harmoinen et al. 2021). Dit is vergelijkbaar met de Wolfiness-markers van Embark. Met deze methode kunnen we met hoge zekerheid de mate van hybridisatie bepalen voor DNA-monsters afkomstig van prooioverblijfselen (Figuur 1).
Bron: https://publicaties.vlaanderen.be/view-file/58277